<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

1.     介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現(xiàn)象原理的分析技術(shù)。光散射是一種物理現(xiàn)象，其中光束由于與足夠小的物質(zhì)粒子相互作用而改變其傳播方向（稱為偏轉(zhuǎn)）。根據(jù)麥克斯韋電磁理論，散射發(fā)生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大，散射越強(qiáng)烈。光散射有兩種類型：1）彈性散射，其中散射光和入射光的波長相同；2）非彈性光散射，其中散射光和入射光的波長不同。只有第一種光散射（彈性）與散射光濁度法和透射光比濁法有關(guān)。

在透射光比濁法中，測量透射光的強(qiáng)度，并在入射光方向（即0°）測量散射導(dǎo)致的入射光強(qiáng)度的衰減，并與入射光強(qiáng)度進(jìn)行比較（空白測量）。被測特性是懸浮顆粒散射效應(yīng)的間接測量，稱為濁度。懸浮樣品對光的任何吸收都會(huì)導(dǎo)致光強(qiáng)度的額外衰減（參見<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，確保被測材料不會(huì)吸收測量波長處的光非常重要。實(shí)際上，控制吸收和濁度測定的方程式是相同的（盡管衰減常數(shù)的值不同）。在散射光濁度法中，測量與入射光傳播方向成90°角的散射光強(qiáng)度。因此，散射光濁度法濁度測量是對懸浮物散射效應(yīng)的直接測量。

2. 術(shù)語和定義

描述濁度法和濁度法的常用術(shù)語包括：

•濁度（符號S）：由于懸浮顆粒的光散射效應(yīng)，透射入射光束強(qiáng)度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過觀察透射光（比濁法）或散射光（濁度法）來測量。

log I₀/I_t = kbc = T

I₀=入射光強(qiáng)度

I_t=透射光強(qiáng)度

k=摩爾濁度系數(shù)

b=樣品池路徑長度

c=濃度

T=濁度

•濁度（符號，τ）：在透射光濁度測量中，濁度是給定懸浮液的入射光束強(qiáng)度/單位長度減少的量度。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織將濁度定義為“由于存在未溶解物質(zhì)而導(dǎo)致液體透明度降低"。

•濁度測量單位：渾濁度單位用一個(gè)描述符表示，該描述符指示測量方法。

•散射光濁度計(jì)濁度單位（NTU）：當(dāng)使用散射光濁度法測量濁度時(shí)，濁度計(jì)以與入射光傳播方向成90°角的角度測量散射光，濁度單位稱為散射光濁度法濁度單位（NTU）。NTU的大小是根據(jù)初級福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)品（一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液）產(chǎn)生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現(xiàn)已上市，并被*為可接受的替代品。然而，所有這些標(biāo)準(zhǔn)都可以追溯到福爾馬肼。初級福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)溶液的濁度為4000 NTU。

其他*的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位（FTU）和福爾馬肼濁度法單位（FNU）。這些單位相當(dāng)于0-40 NTU范圍內(nèi)的NTU。

3.     應(yīng)用

透射光比濁法和散射光濁度法技術(shù)的應(yīng)用包括1）溶液和/或懸浮液的濃度測定（通過在控制良好的反應(yīng)參數(shù)下沉淀和懸浮產(chǎn)生的沉淀物，來測定幾種陽離子和陰離子）；2）測量混濁溶液或懸浮液的濁度；3）測定分子量在1000到數(shù)億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸；4）測量免疫分析的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)或免疫沉淀動(dòng)力學(xué)（比率散射濁度法）；5）監(jiān)測細(xì)胞和細(xì)菌的生長；6）懸浮物粒度分布測定、顆粒計(jì)數(shù)等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，通過測量抗原-抗血清或抗原純化抗體復(fù)合物的光散射反應(yīng)的變化，來計(jì)算導(dǎo)致免疫抗體-抗原沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)的抗原（Ag）或抗體（Ab）的量。通常考慮抗原共價(jià)連接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此產(chǎn)生的技術(shù)被稱為“顆粒增強(qiáng)免疫分析"。雖然這項(xiàng)技術(shù)被稱為散射光濁度法，但通常散射光和透射光都是用比率儀器測量的。

散射光法濁度測量在低濁度范圍（散射介質(zhì)濃度相對較低）更可靠。在該范圍內(nèi)，觀察到樣品濃度與檢測器信號強(qiáng)度（以NTU表示）之間存在線性關(guān)系。隨著濃度的增加，多次散射的入射角也會(huì)增加，從而偏離線性響應(yīng)。支持可靠線性關(guān)系的最大NTU值在1750–2000 NTU范圍內(nèi)。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍（散射介質(zhì)的濃度）。為了獲得一致的結(jié)果，必須仔細(xì)控制所有測量變量。在可能的情況下，可以測量極稀的懸浮液。

4. 儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測量的儀器分別稱為透射光濁度計(jì)和散射光濁度計(jì)。通常，這些儀器包括一個(gè)帶有濾光器的汞燈（用于強(qiáng)綠線或藍(lán)線）、一個(gè)快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個(gè)靈敏的光電倍增管，該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成0°或90°角的位置，或者在一個(gè)臂上，它可以圍繞溶液單元旋轉(zhuǎn)，并通過不透光外殼外的表盤設(shè)置為?135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣，例如用于測量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射為半八角形；圓柱形可適用于所有角度的散射（見圖1）。

圖1.代表性濁度儀。注意，探測器2可安裝在可移動(dòng)臂上。

濁度也可以用標(biāo)準(zhǔn)光電濾光光度計(jì)或分光光度計(jì)測量，最好是在光譜的藍(lán)色部分進(jìn)行照明。散射光濁度法測量需要一個(gè)裝有光電管的儀器，以便接收散射光，而不是透射光。由于這與熒光計(jì)中使用的幾何結(jié)構(gòu)相同，因此可通過適當(dāng)選擇濾光片將其用作濁度計(jì)。比率濁度計(jì)結(jié)合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管，接收和測量與樣品成90°角的散射光，以及接收和測量樣品前面的前向散射光。它還測量直接穿過樣品的光。通過90°角散射光測量值，前向散射光測量值和透射光測量值之和，計(jì)算兩者的比值，可獲得線性度。使用比率濁度測量系統(tǒng)的好處是雜散光的測量變得可以忽略不計(jì)。此外，彩色懸浮液的濁度測定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀（帶比率模式）進(jìn)行，因?yàn)樵摮绦蜓a(bǔ)償了懸浮液顏色導(dǎo)致的光衰減。通常，這些儀器中的光源是鎢燈，在2700 K的燈絲溫度下工作，大部分光強(qiáng)約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常，探測器是▲硅二極管▲和光電倍增管。另一種消除顏色效應(yīng)的方法是使用紅外發(fā)光二極管作為光源，其最大發(fā)射中心約為860 nm，光譜帶寬為60 nm。當(dāng)激光光源也被使用時(shí)，尤其是在濁度測量儀器中，這種技術(shù)通常被稱為“激光濁度測量"。使用激光散射光濁度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是，在非常低的檢測水平下，信噪比顯著提高。通常光源是工作波長為660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子產(chǎn)生更高的散射強(qiáng)度。與吸收未散射光的光阱相結(jié)合，該系統(tǒng)可顯著降低雜散光。當(dāng)專著中的某個(gè)程序指示使用散射光濁度計(jì)或透射光濁度計(jì)時(shí)，可以使用在比率模式下工作的儀器。

5. 福爾馬肼濁度標(biāo)準(zhǔn)

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標(biāo)準(zhǔn)。所有其他標(biāo)準(zhǔn)都是次要的，必須追溯到福爾馬肼。 主要標(biāo)準(zhǔn)在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金書）中被定義為由用戶使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)。

福爾馬肼懸浮液有許多特點(diǎn)，以確保其適合作為主要標(biāo)準(zhǔn)。它可以從試劑級的起始材料中始終如一、準(zhǔn)確地制備。該懸浮液由不同長度和隨機(jī)構(gòu)型的聚合物組成，其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 μm到大于10 μm不等。盡管聚合物鏈長分布已被證明因制備而異，但總的濁度結(jié)果是可以很好地重現(xiàn)的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液的制備

•硫酸肼溶液：將1.000 g ACS級硫酸肼（N₂H₄·H₂SO₄）溶解在100 mL 的A類容量瓶中中，并用無顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時(shí)。

•初級福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液：將2.50 g分析級六亞甲基四胺[(CH₂)₆N₄]溶于25.0 mL無顆粒水中，裝入100 mL燒瓶。使用A類25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時(shí)。由此產(chǎn)生的懸浮液可穩(wěn)定運(yùn)行2個(gè)月。

•福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液1：使用15 mL A類移液管，將15 mL福爾馬肼初級標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

•福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液2：使用50 mL A類移液管，將50 mL福爾馬肼初級標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

•福爾馬肼參考懸浮液：根據(jù)表1，在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液和無顆粒水，制備福爾馬肼參考懸浮液。